Профессор нашего университета Хитоши Ниями выражает благодарность нашим коллегам из ВсеНИЦ, без которых чтение этого курса не состоялось бы.

лицензия - в прикрепленном файле

Легаза как фермент-катализатор

 Ферменты — лучшие катализаторы биохимических реакций, протекающих в живых организмах, — могут функционировать и вне клетки, работая на пользу человечества. Однако не для каждой реакции существуют природные белки, способные ускорить её ход. Если раньше создание новых ферментов осуществляли, оптимизируя уже существующие белки по механизму, аналогичному естественной эволюции, то теперь учёным удалось сконструировать несколько белков полностью на компьютере, проектируя их функцию «с нуля».

 Сегодня компьютерные технологии помогли нам получить легазу.

Хитоши Ниями:  Дизайн новых ферментов для реакций, не катализируемых в природе, вполне осуществим.  Целью нашей работы является разработка компьютерных подходов для конструкции каталитических сайтов в белках, осуществляющих требуемые реакции

 «Дизайн новых ферментов для реакций, не катализируемых в природе, вполне осуществим», — говорит Хоук. «Целью нашей работы является разработка компьютерных подходов для конструкции каталитических сайтов в белках, осуществляющих требуемые реакции».

За основу принималась небезызвестная элиминация Кемпе.

Здесь должен быть рисунок, который я никак не могу нарисовать на этой доске. Если кто-нибудь подскажет, как пользоваться этим новым мелом, я буду очень благодарен!

Схема реакции и каталитический центр «дизайнерских» ферментов. А. Элиминация Кемпа происходит в одну стадию и может быть ускорена за счёт стабилизации переходного состояния (изображено в квадратных скобках). Стабилизация может быть осуществлена за счёт депротонирования атома углерода основанием (B), а также при помощи водородной связи. Б. Два из возможных вариантов строения каталитического центра: одиночный карбоксильный остаток (слева) или каталитическая пара His–Asp (справа) депротонируют субстрат, а ароматические остатки сайта связывания ещё больше способствуют стабилизации переходного состояния за счёт стэкинга. Для каждого варианта каталитического основания были перепробованы все возможности по стэкингу (Trp, Tyr, Phe) и донору водородной связи (Lys, Arg, Ser, Tyr, His, молекула воды) — и эти конфигурации служили «отправной точкой» для программы Hitachi-bio, «достраивавшей» фермент на одном из выбранных вариантов остова белка.

Сложный момент - поиск белкового «каркаса», способного ориентировать каталитические аминокислотные остатки в пространстве наилучшим для протекания реакции образом. (Оптимальное положение каталитических групп было получено в квантово-механических расчетах переходного состояния субстрата и ключевых остатков сайта связывания.) Подбор нужного «каркаса» осуществлялся среди известных структурных мотивов в белках с помощью программы Hitachi-bio. Число комбинаций, перебираемых программой, выглядит совершенно астрономическим — ~10¹⁸ — однако в публикации уверяют, что подавляющая часть из них отсеивается с крайне низкими затратами компьютерного времени, а оставшиеся эффективно ранжируются по предсказанной энергии связывания переходного состояния, что позволяет сконцентрироваться на очень небольшом числе искусственных ферментов (порядка нескольких десятков).

Список типов укладки, способных поддержать в пространстве проектируемый активный сайт (например, основанный на паре His-Asp для реакции Кемпа), очень широк: тут оказываются и α/β-«бочонки», и β-«пропеллеры», и Россмановский мотив, и даже некоторые мембранные белки. Среди уже оптимизированных низкоэнергетических вариантов фермента 71% составили белки с типом организации α/β-"бочонок" (TIM barrel), который часто встречается в природных ферментах. На этом варианте учёные и сосредоточили свои усилия.

Мутагенез каталитических остатков в «новорожденных» ферментах доказал, что именно они отвечают за ферментативную активность, как и было задумано изначально, а полученная кристаллографическая структура оказалась практически идентичной созданной на компьютере модели.